Prevotella sp. y Porphyromonas sp. en la periodontitis del adulto

INTRODUCCIÓN

La periodontitis es una entidad caracterizada por un conjunto de alteraciones del órgano dentario, debido a que se afectan los tejidos de soporte del diente, en los cuales están involucrados ciertos microorganismos patógenos(1,2,3,4). El desarrollo de las técnicas anaerobias durante los últimos 20 años han aclarado considerablemente la etiología de la periodontitis, y se han establecido grupos de microorganismos específicos presentes en dicha enfermedad. La microbiota periodontal es una comunidad compleja de microorganismos, principalmente anaerobios, muchos de los cuales aún son difíciles o imposibles de aislar en el laboratorio. A pesar de las dificultades para aclarar los aspectos microbiológicos de la periodontitis, hoy en día se conoce un grupo limitado de patógenos  y en la actualidad se estudian las propiedades de dichos microorganismos que les permiten actuar como patógenos en el tejido periodontal (5,6,7).

Durante muchos años se ha estudiado la flora bacteriana predominante en la periodontitis. Como agentes etiológicos relacionados con esta enfermedad, se le ha dedicado particular atención a Actinobacillus actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum y a especies de bacterias Anaerobias Gram Negativas Pigmentadas (BAGNP) (8,9,10,11,12). Diversas investigaciones reportan que dentro del grupo de estas bacterias AGNP, especies  de  Prevotella y Porphyromonas, constituyen un grupo de microorganismos predominantes en la etiología de la Periodontitis del Adulto, y aparentemente cumplen un papel importante en el desarrollo de esta enfermedad (13,14,15,16); razón por la cual, es necesario su aislamiento e identificación para conocer  la frecuencia de estos microorganismos en este tipo de enfermedad.

Aún cuando se ha demostrado en países desarrollados, que la Periodontitis del Adulto es una enfermedad en la cual se ha implicado muchos microorganismos, n nuestro medio los datos microbiológicos con respecto a la etiología y  papel de las bacterias anaeróbicas  en esta  enfermedad periodontal son escasos. Esta información deficiente puede ser debido a la falta de proyectos de investigación que demuestren la microbiota en esta enfermedad y a la falta de registro adecuado de los datos clínicos y epidemiológicos. Estos hechos, aunados a que en Venezuela la periodontitis sólo se diagnóstica clínicamente, justifican la realización de una investigación orientada a la búsqueda de datos microbiológicos en pacientes adultos  con periodontitis,  que acudan a la Facultad de Odontología de la Universidad  Central de Venezuela, con la finalidad de aportar  datos microbiológicos, en el área de la salud, especialmente a los Odontólogos y Microbiólogos de nuestro país.

Por lo anteriormente expuesto, el objetivo de este trabajo fue: Determinar la presencia de Prevotella  sp. y Porphyromonas sp. en pacientes con  Periodontitis del Adulto que acudieron a consulta en la Facultad de Odontología de la Universidad Central de Venezuela.

MATERIALES Y MÉTODOS

De la población de pacientes que asistieron a consulta odontológica en la Facultad de Odontología de la UCV, durante los meses de Octubre de 1998 hasta Febrero de 1999, se eligieron 30 pacientes adultos, entre 25 y 65 años de edad, de uno u otro sexo, con  diagnóstico clínico y radiográfico de periodontitis, sin haber recibido tratamiento antimicrobiano.  Así mismo, se eligieron 15 pacientes adultos periodontalmente sanos, que sirvieron como grupo control. A cada paciente se le registraron los datos personales, clínicos, radiográficos y microbiológicos en una ficha, elaborada para tal fin.

Posteriormente a cada paciente del grupo de estudio, se le tomó una muestra en  los sacos periodontales (³ 4 mm) formados alrededor de los dientes superiores o inferiores, en tanto que a los pacientes del grupo control se les tomó una muestra de placa subgingival en los dientes  superiores o inferiores. Las muestras de los sacos periodontales fueron tomadas con tres conos de papel esterilizados, de los cuales se colocaron dos en el medio de transporte Caldo Tioglicolato pre-reducido y el otro en Agar Anaeróbico Schaedler con suplemento 107 (OXOID). Las muestras de placa subgingival se tomaron con curetas periodontales previamente esterilizadas y fueron colocadas en los mismos medios mencionados anteriormente. El medio de transporte Caldo Tioglicolato pre-reducido, conteniendo  la muestra  obtenida, fue trasladado inmediatamente al Laboratorio de Microbiología de la Cátedra de Microbiología de esta Facultad. A partir del mismo, se efectuó la siembra en medios de cultivo Agar Sangre Base Schaedler 107 y Agar Sangre Base Schaedler para el aislamiento de anaerobios.

Las condiciones de anaerobiosis se proporcionaron mediante la jarra anaeróbica (Gaspak) y el sobre generador de CO2 y H2; dichas jarras se incubaron a una temperatura de 37 ºC durante 7 días, al cabo de los cuales, se observó el crecimiento bacteriano en los cultivos primarios, a través de un microscopio estereoscópico. Luego se subcultivaron las colonias pigmentadas negras sospechosas de Prevotella sp. y Porphyromonas sp. para su purificación  en Caldo Schaedler y Agar Sangre Base Schaedler, bajo las mismas condiciones de anaerobiosis anteriormente descritas. Una vez purificadas las colonias se procedió a efectuar la identificación a través de las pruebas enzimáticas estandarizadas RAPID ID 32A (BIOMERIUX), y posteriormente fueron leídas  a través del ATB EXPRESS.

RESULTADOS

En el presente trabajo fueron estudiadas  45 muestras provenientes de pacientes adultos que acudieron a consulta odontológica en la Facultad de Odontología-UCV, de los cuales 30 presentaron periodontitis y 15 otras patologías que sirvieron como grupo control.

De los 30 pacientes con periodontitis, 1 (3.33%) pertenece al grupo etario ubicado entre 20 y 29 años, 6 (20%) al grupo ubicado entre 30 y 39 años, 13 (43.33%) ubicados entre 40 y 49 años, 7 (23.33%) entre 50 y 59 años y los otros 3 (10%) entre 60 y 69 años de edad.  Con respecto a los 15 pacientes  controles,  1 (3.33%) pertenece al grupo etario ubicado entre 20 y 29 años, 5 (33.33%) al grupo ubicado entre 30 y 39 años, y los 10 restantes entre 40 y 59 años de edad (Gráfico1). Se estudiaron en total 14 pacientes de sexo masculino, 8 (26.67%) con periodontitis y 6 (40%) controles, y 31 del sexo femenino, 22 (73.33%) con periodontitis y 9 (60%) controles (Gráfico 2).

El crecimiento bacteriano en el  Agar Schaedler fue claramente evidenciado, por la aparición de colonias características en la superficie del agar, las cuales eran negras, lisas, brillantes, convexas y pequeñas, diferenciándose  de otros tipos de colonias en el medio. Las colonias con las características antes mencionada, fueron consideradas como sospechosas de bactes AGNP (Figura 1).

Inicialmente se aislaron 60 cepas de bacterias anaerobias de los cultivos primarios, de las cuales 39 se mantuvieron viables. De éstas últimas, 27 (69.23%) correspondían a bacterias AGNP, de ellas se identificaron 18 (46.15%) como Prevotella sp. y 9 (23.08%) como Porphyromonas sp. También se aislaron otras bacterias anaeróbicas, pertenecientes a los géneros Actinomyces sp. (12.82%), Fusobacterium sp. (7.69%), Bacteroides sp. (2.57%) (Tabla 1).

Del total de los 30 pacientes con periodontitis, a quienes se les tomaron muestras de sacos periodontales, se les observó el crecimiento de colonias características en Agar Schaedler de bacterias AGNP, de los cuales, a 13 (40.33%) de ellos se les identificó como Prevotella sp., a 4 (13.33%) como Porphyromonas sp. y  5 (16.67%) como Prevotella sp. y Porphyromonas sp., 5 (16.66%) otros anaerobios y en los pacientes restantes  no fue posible la identificación de las cepas. Con respecto a los 15 pacientes del grupo control, a quienes se les tomaron muestras de placa subgingival, solo a 5 (33.33%) se les observó crecimiento de colonias características en Agar Schaedler,  identificándose como Prevotella sp. (Gráfico 3).

En el grupo de pacientes con periodontitis, la mayor frecuencia de AGNP se observó en el sexo femenino con 17 casos (56.67%) y 5 (16.67%) casos fueron observados en el sexo masculino (Tabla 2). Al relacionar las bacterias anaerobias aisladas con la edad de los pacientes con periodontitis, se encontró que los AGNP eran las bacterias más frecuentemente aisladas en pacientes mayores, especialmente en el grupo de 40 a 49 años (Gráfico 4).

De los pacientes estudiados con periodontitis, 25 (83.33%) afirmó no padecer de alguna enfermedad predisponente; solo 1 (3.33%) confirmó padecer de Diabetes.

Con respecto a las características clínicas, se pudo observar que todos los casos (100%) presentaban inflamación, sacos periodontales entre 4 y 10 mm, así como sangramiento, exudado purulento y movilidad dentaria. Al relacionar las bacterias anaerobias aisladas con la profundidad de los sacos periodontales, se encontró que las bacterias AGNP se aislaron con mayor frecuencia en aquellos pacientes que presentaron sacos periodontales con una profundidad de 5 mm o más (Gráfico 5).

Del análisis de estos resultados, se puede observar que de los 30  pacientes con periodontitis, se obtuvieron 27 cepas características de bacterias AGNP, de los cuales se pudo determinar la presencia de Prevotella sp. en 18 pacientes y solo en 9 pacientes  Porphyromonas sp.

DISCUSIÓN

La  periodontitis constituye un conjunto de alteraciones del tejido de sostén del órgano dentario, generalmente precedida de gingivitis, debido a que se afectan el ligamento periodontal, el hueso alveolar,  y los tejidos blandos alrededor de los mismos (1,2,17). Algunos autores definen a la periodontitis como un proceso infeccioso relacionado con la acumulación  de  placa y  cálculo dental, siendo los microorganismos anaerobios los principalmente involucrados (3,18,19,20,21,22,23).

De los tipos de periodontitis, la Periodontitis del Adulto es la más común y frecuente. Esta enfermedad se caracteriza por presentar diversos grados de inflamación, por la formación de sacos periodontales y por la pérdida del hueso alveolar. La encía puede sangrar al ser examinada y en etapas más avanzadas hay retracción de la misma, y movilidad dentaria (1,2,4,17).

Varios autores coinciden que la periodontitis afecta a individuos de diferentes edades, y de todas, el tipo más frecuente es la Periodontitis del Adulto, que puede iniciarse en el adulto joven y progresa durante toda la vida, pero en general es  clínicamente significativa a partir de 35 años de edad (1,2,4). En este estudio, el mayor porcentaje de pacientes con periodontitis estuvo representado en los adultos mayores de 30 años de edad, especialmente entre 40 y 49 años. Estudios realizados por diversos investigadores, señalan a la edad como un factor de riesgo que favorece el desarrollo de la periodontitis; a medida que se incrementa la edad, el número de individuos afectados y la severidad de la enfermedad aumenta (1,2,3,4,17,24).

En cuanto al sexo, algunos autores señalan que la periodontitis del adulto no tiene preferencia por ninguno de los sexos; sin embargo, se puede presentar una exagerada inflamación en el tejido durante los períodos de cambios hormonales, inducidos por el incremento de estrógenos y progesterona circulantes; al parecer las  hormonas femeninas estimulan el crecimiento de ciertos periodontopatógenos (2,3).

Al  analizar  los  factores   de   riesgo,  se   encontró  que    83.33%  de los  pacientes  no padecía   ninguna enfermedad predisponente  asociada a la periodontitis, sólo uno (3.33%) afirmó padecer de Diabetes. Se ha establecido que la Diabetes constituye un factor de riesgo importante en la progresión de la periodontitis, ya que estos pacientes presentan formación de sacos periodontales más profundos, pérdida de la inserción periodontal más rápida y pueden desarrollar abscesos periodontales (25).

Autores como Genco (1990), Wolff (1994) y Page (1995), indican que existen otros factores que pueden predisponer a dicha enfermedad, independientes a las condiciones clínicas del paciente, tales como edad avanzada, pocas visitas al odontólogo y escasa higiene bucal. En el presente estudio, estos factores pudieron haber  influido para que los pacientes desarrollaran periodontitis, lo cual ha sido demostrado en poblaciones de países subdesarrollados, donde no se practica una adecuada higiene bucal (1,12,17).

La inflamación, sangramiento, exudado purulento, profundidad del saco periodontal, movilidad y pérdida ósea, son signos clínicos que facilitan el diagnóstico y a su vez proveen información sobre la extensión de la periodontitis y la condición actual de los tejidos (1,2,4,26).  Kamma y colaboradores (1994), examinaron la frecuencia de dichos signos, así como el porcentaje de microbiota subgingival aislada de adultos con lesiones asociadas a periodontitis de progresión rápida,  encontraron  predominio de P. gingivalis, F. nucleatum y Bacteroides  forsythus en sacos periodontales profundos, mientras que P. intermedia estuvo fuertemente asociada con la presencia de sangramiento y exudado purulento (27). Los resultados obtenidos en este estudio, posiblemente tengan esta misma relación, al compararlos con los AGNP aislados. Porphyromonas sp. se aisló principalmente en pacientes que presentaron sacos periodontales con una profundidad mayor de 5 mm. o más. Sin embargo, varias cepas de Prevotella sp. se encontraron  en  sacos periodontales  de 4 mm. Estos resultados sugieren que Porphyromonas  sp. se aíslan más en  sacos profundos que en  lesiones pequeñas, lo cual concuerda con un estudio realizado por Petit (1994), donde demostró que las bacterias AGNP, se aislaban con mayor frecuencia en sacos profundos mayores de 4 mm (9).

La periodontitis está relacionada con una microbiota compleja, la cual  comprende bacterias anaerobias Gram negativas y Gram positivas, así como bacterias  anaerobias facultativas (23,24,28), de ellas las bacterias AGNP juegan un papel importante en el desarrollo de la Periodontitis del Adulto (7,15). Diversos  estudios realizados en adultos con periodontitis, han demostrado que Porphyromonas sp. y Prevotella sp. son las bacterias más frecuentes en este proceso infeccioso y se ha identificado en muestras de placa subgingival y sacos periodontales a través de diferentes pruebas (8,9,10,11,20,21,29).

En un estudio realizado por Moore y col., en 1991, en lesiones activas de pacientes con periodontitis crónica  del  adulto,  encontraron   que   los   microorganismos   predominantes   eran   P. gingivalis, P. intermedia, B. forsytus, Campilobacter rectus, F. nucleatum, Eikenella corrodens y treponemas; mientras que en los sitios inactivos se observaron Streptococcus sp., Veillonella sp. y Actinomyces sp. (30).

De los resultados obtenidos en este estudio, se puede observar que de  los 30  pacientes estudiados con periodontitis, se obtuvieron 27 cepas características de bacterias AGNP, con lo cual se pudo determinar Prevotella sp. en 18 pacientes y  en 9 pacientes Porphyromonas sp., por lo tanto, éstas fueron las bacterias involucradas como agentes periodontopatogénicos  en la mayoría de los pacientes adultos estudiados. Estos hallazgos coinciden con un reporte publicado por Moreno y col. en 1996, quienes hicieron un estudio en 37 pacientes  adultos con periodontitis, identificándose 15 cepas (40.5%) como Prevotella sp. y 5 (13.5%) como Porphyromonas sp. (31)..

En un estudio realizado por Grenier y Turgeon (1994), demostraron la presencia de P. gingivalis y P. intermedia en Periodontitis del Adulto, sin embargo, no siempre estas bacterias proteolíticas son las más numerosas en sacos periodontales. No obstante, en otro estudio en pacientes con esta misma patología, se encontraron otras bacterias proteolíticas tales como Capnocythophaga sp., Peptostreptococus  micros, y Actinomyces sp., las cuales pueden contribuir significativamente  a la actividad proteolítica encontrada en los sitios afectados (23).

Los hallazgos de este estudio coinciden con los de Monbelli  y col., (1991), que  estudiaron 10 pacientes con múltiples sacos periodontales mayores de 5 mm y con evidencia radiográfica de pérdida del hueso alveolar, del cual se evidenció que en 7 pacientes se aisló Porphyromonas sp., lo que correspondió a un 70%. Igualmente en un estudio realizado por Petit (1994), se estudiaron 24 familias,  y de éstas, en 18 (75%) se identificó Porphyromonas sp. (9).

En este estudio, de los 30 pacientes con periodontitis, a 13 (40.33%) de éllos se les identificó como Prevotella sp., a 4 (13.33%) Porphyromonas sp., y a 5 (16.67%) Prevotella sp. y Porphyromonas sp., observándose que Prevotella sp. es la más frecuente en todas las edades, y Porphyromonas sp., en  pacientes mayores de  30 años, lo cual coincide con reportes previos, por cuanto dichas bacterias están asociadas principalmente con la Periodontitis del Adulto (18,23).

Estas bacterias, Porphyromonas sp. y Prevotella sp. forman parte de un grupo de bacilos Gram  negativos anaeróbios  que producen colonias pigmentadas en agar sangre. De estos dos Géneros, Porphyromonas es  más virulenta por poseer una batería de enzimas proteolíticas, de toxinas capaces de destruir los tejidos, así como también propiedades para la inactivación de los mecanismos de defensa del hospedero. Sin embargo,  el Género Prevotella  se encuentra comúnmente en sujetos con periodontitis y se ha comprobado su capacidad para degradar inmunoglobulinas, su acción tóxica sobre fibroblastos, y su actividad fibrinolítica (21,22,23,24). Ambos microorganismos poseen propiedades patogénicas y producen factores de virulencia, que los capacita para la destrucción del tejido. Actualmente se incluyen entre el grupo de patógenos periodontales, conjuntamente con A. actinomycetemcomitans, B. forsythus y Capnocytophaga sp. (32).

Otras bacterias anaerobias aisladas en este estudio y que a su vez se encontraban asociadas a las del grupo AGNP fueron Actinomyces sp., Fusobacterium sp. ,y Bacteroides sp. Al respecto, Kamma y col., (1995), señalan que la colonización de los dientes por Actinomyces sp. en coagregación con  F. nucleatum y otras especies, conlleva a producir irritación de los tejidos, sangramiento y exudado, que a la vez estimula a Porphyromonas sp., Prevotella sp. y otros microorganismos, a la destrucción del tejido, favoreciendo así el desarrollo de la periodontitis (7).

Investigaciones realizadas indican algunas diferencias cualitativas y cuantitativas con respecto a la microbiota periodontal. Estas variaciones pueden explicarse por las diferencias en la severidad y patrones de periodontitis reportadas en varias partes del mundo (14,21); así como también por  el número de pacientes y sitios de muestras recolectadas, y por los métodos de diagnósticos utilizados mucho más específicos y sensibles que los cultivos bacterianos. Sin embargo, la identificación de estas especies bacterianas, Porphyromonas y Prevotella, a través de métodos microbiológicos, representa una alternativa importante para el diagnóstico de la Periodontitis del Adulto.

Los hallazgos de este estudio sugieren continuar el presente trabajo examinando pacientes de diferentes grupos de edad con o sin periodontitis, antes y después de aplicar un tratamiento periodontal, ya que en nuestro medio, no existen suficientes reportes acerca de las bacterias anaerobias en la etiología de la Periodontitis del Adulto.

CONCLUSIONES

• El mayor porcentaje de pacientes con Periodontitis del Adulto estuvo representado por los pacientes mayores de 30 años de edad, especialmente en el grupo de 40-49años, y por el sexo femenino.
• La mayor frecuencia de bacterias AGNP se observó en el sexo femenino, con 17 casos (73,23%), y 5 casos (22,72%) casos fueron observados en el sexo masculino. Prevotella sp. fue más frecuente en todas las edades, y Porphyromonas sp., fue la más frecuente  en los pacientes mayores de  30 años.
• Las bacterias AGNP se aislaron con mayor frecuencia en aquellos pacientes  que presentaron sacos periodontales  con  una  profundidad  de 5 mm o más.
• De  los 30  pacientes estudiados con periodontitis, se obtuvieron 27 cepas características de bacterias AGNP, en los cuales se pudo determinar la presencia de Prevotella sp. en 18 (60 %) pacientes y sólo en 9 pacientes Porphyromonas sp.
• Otras bacterias anaerobias aisladas con menor frecuencia fueron Actinomyces sp., Fusobacterium sp. y Bacteroides sp.

AGRADECIMIENTO

Al C.D.C.H.T, organismo que financio la investigación

Al Instituto Nacional de Higiene por su colaboración prestada

BIBLIOGRAFÍA

1. Page, R.; Sjöstron, K; Ou, J; Chen, H. (1993): Clinical and Inmunologic aspects of periodontitis. Inmunology and allergy clinics of North America. 13 (2): 487 - 505.
2. Carranza, F and Newman, M. (1997): Periodontología Clínica. Octava Edición.  México. Ediciones   Mc Graw-Hill Interamericana.
3. Marsh, P. and Martin, M. (1984): Oral Microbiology  2da. Edition. Berchire. England. VNR Internacional.
4. Ranney, R. (1993): Classification of periodontal diseases. Periodontology 2000.
5. Sundqvist, G. (1993): Pathogenicity and virulence of Black Pigmented Gram negatives anaerobes. Immunol. Med. Microbiol. 6: 125 – 138. J. Periodontol. Res. 22: 300 -306.
6. Shah, H. and Gharbia, S. (1994): Progress the identification of Nonmotile Bacteroiidaceae from dental plaque. Clin. Infect. Dis. 18 (Supple 4): 287 – 292.
7. Kamma, J.; Nakou, M. and  Manti, F. (1995): Predominant microflora of severe, moderate and minimal periodontal lesions in young adults with rapidly progressive periodontitis. J. Periodontol. Res. 30: 66-72.
8. Slots, J. and Lisgarten, M. (1988): Bacteroides gingivalis, Bacteroides intermedius and Actinobacillus actinomycetemcomitans in human periondontal diseases. J. Clin. Periodontol. 5: 85-93.
9. Petit, M.; Steenbergen, T.: Timmerman. M.; De Graaff, J.; Van derVelden, U. (1994): Prevalence of periodontitis and suspected periodotal pathogens in families of adult periodontis patiens. J. Clin. Periodontol. 21: 76-85.
10. Monbelli, A.; Mc Nabb, H.; Lang, N. (1991): Black- pigmenting Gram-negative bacteria in Periodontal Disease. I Topografic distribution in the human dentition J. Periodont. Res. 26: 301- 307.
11. Monbelli, A.; Mc Nabb, H.; Lang, N. (1991a): Black- pigmenting Gram-negative bacteria in Periodontal Disease. II Screening strategies for detection of P. gingivalis. J. Periodont. Res. 26: 308-313.
12. Wolff, L.; Dahlen, G. and Aeppli D. (1994): Bacteria as Risk Markers for Peridontitis. J. Periodontol. 64:498 - 510.
13. Van WinKelhoff, V.;  Van Steenbergen, T. and De Graff,  J. (1988): The role of black pigmented Bacteroides in human oral infections. J. Clin. Periodontol. 15: 145 - 155.
14. Nakagawa, T.; Yamada, S.; Tsunoda, M.; Sato, T.; Naito, Y; Takazoe I. and Okuda, K. (1990): Clinical, Microbiological, and inmunological estudies following initial preparation in adult periodontitis. Bull. Tokyo. dent. Coll. 31 (4): 321 - 331.
15. Okuda, K. (1994): Bacteriological Diagnosis of Periodontal Disease. Bull. Tokyo. Dent. Coll. 35 (3) 107 – 119.
16. Finegold, S. (1995): Overview of Clinically Important Anaerobes Clin. Inf. Dis. 20 (suppl 2):205– 207.
17. Genco, R. Golman, H.; Cohen, D. (1990): Periodoncia. Editorial McGraw-Hill. Interamericana. México.
18. Dahlén, G. (1993): Role of Suspected Periodontopathogens in Microbiological Monitoring of  Periodontitis. Adv. Dent. Res. 7(2): 163- 164.
19. Watson, M.; Bretz, W.; and Loesche, W. (1994): Presence of Treponema denticola and Porphyromonas gingivalis in children correlated with Periodontal Disease of their parents. J. Dent. Res. 73 (10): 1636 – 1640.
20. Lisgarten, M.; Wong, M. and Lai, C. (1995): Detection of Actinobacillus actinomicetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, and Bacteroides forsythus in positive Patient Population. J. Periodontol. 66: 158 – 164.
21. Offenbacher, S.; Odle, B and Van Dike, T. (1995): The microbial morphotypes associated with periodontal health and adult periodontitis: composition and distribution. J.Clin. Periodontol.  12:736-749.
22. Gharbia, S. and Shah, H. (1994): Hidrolitic enzymes liberated by Black Pigmented  Gram negatives anaerobes. Immunol. Med. Microbiol.  6: 139 – 146.
23. Grenier, D. and Turgeon, J. (1994): Ocurrence and identity of proteolytic bacteria in adult periodontitis. J. Periodontol. Res.   29: 365 – 370.
24. Petsios, A., Nakou, M. and Manti, F. (1995): Microflora in adullt.J.Periodontol.   30: 325 – 331.
25. Bridges, R.; Anderson, J.; Saxe, S., Gregory, S.; Brides, S. (1996): Periodontal status of Diabetic and Non Diabetic Men: Effects of Smoking, Glycemic Control, and Socioeconomic Factors. J. Periodontol. 67 (11): 1185 – 1192.
26. Sloltenberg, J.; Osborn, J.; Pihlstrom, B.; Hezberq, M.; Aeppli, D; Wolff, L.; Fischer, G. (1993): Association Between Cigarrette Smoling, Bacterial Pathogens and Periodontal Status J. Periodontol.   64 (12): 1225 - 1230.
27. Kamma, J.; Nakou, M. and  Manti, F. (1994): Microbiota of  Rapidly Progressive Periodontitis Lesions in Association With Clinical Parameters. J. Periodontol.   65: 1073 – 1078.
28. Duerden, B. (1994.): Virulence Factors in Anaerobes. Clin.Infect.Dis.   18 (Suppl4): 253 – 259.
29. Kojima, T;Yasui, S.; Ishikawa, I. (1993) Distribución of Porphyromonas gingivalis in Adult Periodontitis Pacients. J.  Periodontol. 64 (12): 1231-1237.
30. Moore, W.; Ranney, R.; Smibert, R., Burmeister, J., and Schenkein, H. (1991): The microflora of   periodontal sites showing active destructive progression. J. Clin. Periodontol.   18: 729-739
31. Moreno,V.;Romero, P.; Nieves, B. (1996): Características Clínicas, Epidemiológicas y Microbiológicas en la periodontitis del adulto asociada a bacterias anaeróbicas.   Trabajo de Grado Escuela de Bioanálisis. ULA.
32. Raouf, W.; Bakken, V., Nilsen; R. and Skaug, N. (1994): Comparative detection frecuency of 6 putative Periodontal Pathogens in Sudanese and Norwegian Adult periodontitis Patients. J. Periodontol.   65:1046 – 1052.