Trabajo Original

Cultivo y diferenciación in vitro de células mesenquimales de pulpa dentaria humana hacia el linaje odontogénico-osteogénico en matrices tridimensionales de Colágeno Tipo I

Recibido para Arbitraje: 29/09/2015
Aceptado para Publicación: 09/10/2015

Camejo Suárez, Ma. V.1; Merentes Díaz, E.2

Resumen

Las células madre adultas tienen un gran potencial, para ser utilizadas en la terapia celular y la ingeniería de tejidos. El objetivo del presente trabajo de investigación es determinar la capacidad de diferenciación in vitro de las células madre mesenquimales adultas de la pulpa dentaria humana hacia el linaje odontogénico-osteogénico, con el uso de factores inductores en el medio (10 mM β-GP, 10-8 M dexametasona y 50 μg/mL ácido L-ascórbico) y una matriz tridimensional de colágeno natural tipo I, preparada a partir de cola de rata. Para aislar las células, se utilizó el método de disgregación enzimática. Fueron cultivadas en medio DMEM-F12 suplementado con 15% de SFB, 100 μM L-ácido ascórbico 2-fosfato, 2 mM L-glutamina y antibióticos-antimicótico. Células de 1 línea celular (1 paciente), se sembraron en matrices de gel de colágeno, de dos maneras: 1) Inmersas en la matriz natural de colágeno tipo I, y 2) Sobre la matriz natural de colágeno tipo I. Los resultados mostraron diferencias en las características morfológicas de las células sembradas inmersas y sobre la matriz, sin embargo, algunas células cambiaron hacia una morfología semejante a odontoblastos, se observó la expresión de la DSP y la formación de depósitos calcificados Rojo Alizarina “positivos”, sugerentes a una diferenciación odontoblástica en ambos métodos, especialmente a los veintiún días de la inducción. Las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana aisladas e inducidas a la diferenciación odontogénica-osteogénica en sustrato tridimensional (matriz de colágeno) lograron diferenciarse en células semejantes a odontoblastos.

Palabras clave: Células madre mesenquimales, pulpa dentaria, diferenciación in vitro, matriz de colágeno.


Original work

Cultivation and differentiation in vitro of mesenchymal cells of human dental pulp into odontogenic-osteogenenic lineage in tridimensional matrices of collagen Type I

Abstract

Adult stem cells have great potential, to be used in cell therapy and tissue engineering. The objective of this research work is to determine the ability of in vitro differentiation of mesenchymal stem cells from adult human dental pulp into odontogenic –osteogenic lineage , with the use of inductors factors in the medium (10 mm β-GP, 10-8 M dexamethasone and 50 μg/ml L-ascorbic acid) and a three-dimensional matrix of natural collagen type I, prepared from a rat tail. To isolate the cells, we used the method of unbundling enzyme. They were cultured in DMEM-F12 medium supplemented with 15% FBS, 100 μm L-ascorbic acid 2-phosphate, 2 mm L-glutamine and antibiotic-antimycotic. Cells of 1 cell line (1 patient), were planted in arrays of collagen gel, in two ways: 1) immersed in the natural matrix of collagen type I and 2) on the natural matrix of collagen type I. The results showed differences in the morphological characteristics of the cells seeded immersed and on the array, however, some cells changed toward a morphology similar to odontoblasts, we observed the expression of the DSP and the formation of calcified deposits alizarin red "positive", suggesting a differentiation odontoblastic in both methods, especially to the twenty-one days of the induction. The mesenchymal cells of the isolated human dental pulp and induced to differentiate odontogenic-osteogenenic in dimensional substrate (collagen matrix) achieved differentiate into cells similar to odontoblasts.

Key words: Dental pulp, Mesenchymal stem cells, Diferentiation in vitro, Collagen matrix


  1. Profesor Titular de la Cátedra de Endodoncia de la Facultad de Odontología de la Universidad Central de Venezuela.
  2. Profesor Titular de la Facultad de Ciencias de la Universidad Central de Venezuela. Instituto de Biología Experimental, IBE. Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Biología de Tumores
  3. CORRESPONDENCIA: valen_camejo@hotmail.com

    RECONOCIMIENTO: Quiero expresar mi agradecimiento al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico (CDCH) de la Universidad Central de Venezuela por el apoyo financiero a través del Proyecto Individual: PI-7507-2009, necesario para llevar a cabo esta investigación. Al Postgrado de Cirugía Bucal de la Facultad de Odontología de la Universidad Central de Venezuela por su colaboración en el suministro de las muestras (terceros molares) para llevar a cabo esta investigación.

INTRODUCCIÓN

Las matrices o soportes estructurales proporcionan un microambiente biológico y fisicoquímico tridimensional (3D) para el crecimiento y diferenciación celular. También, promueven la adhesión y la migración celular. Las matrices sirven como un transporte para los morfógenos en la terapia de proteínas y para las células en la terapia celular. Pueden ser efectivos en el transporte de nutrientes, oxígeno y desechos1. En la ingeniería de tejidos es un elemento crítico2.

El aislamiento de las células madre mesenquimales de la pulpa dentaria provee la posibilidad de reparar dientes dañados con tejido del mismo paciente. Para la ingeniería de tejidos se propone que las células deben ser sembradas sobre matrices o soportes. Sin embargo, no se ha descrito si los materiales de las matrices influyen en el comportamiento de las células madre de la pulpa dentaria3.

La selección de un material apropiado de la matriz es de decisiva importancia para inducir y conferir la formación óptima de nueva matriz de dentina. Así, la matriz o el soporte estructural más conveniente dependen de las propiedades químicas y físicas del material, así como, de la estructura geométrica, actualmente, sujetas a investigación. Esencialmente, el biomaterial tiene que cumplir las siguientes características: ser biocompatible y no toxico; cumplir con las características biomecánicas que incluyen tensión, compresión y resistencia a la flexión; ser conductiva para las células semejantes a odontoblastos; bioresorbible y bioactivo4.

Las matrices de polímeros imitan muchas funciones de la matriz extracelular encontrada en los tejidos. Esta última comprende de varios aminoácidos y macromoléculas basadas en azúcares, une a las células, controla la estructura del tejido, regula la función de las células y permite la difusión de nutrientes, metabolitos y factores de crecimiento2. Generalmente, los dos tipos principales de matrices de materiales poliméricos, que se utilizan en las estrategias de ingeniería de tejidos son el colágeno derivado de animal y los polímeros sintéticos de ácido láctico y ácido glicólico5. Sin embargo, también, se utilizan los hidrogeles sintéticos como el polietilen-glicol, las matrices que contienen compuestos inorgánicos tales como, hidroxiapatita y fosfato de calcio1, las mallas de fibra de titanio3 y el alginato, como soportes de las células mesenquimales de la pulpa dentaria6.

A) Matriz de gel de colágeno

El colágeno es el polímero natural derivado de tejido más ampliamente utilizado y es el principal componente de la matriz extracelular de los tejidos de mamíferos, como: la piel, el hueso, el cartílago, el tendón, el ligamento7 y la pulpa dentaria8. Además, es un componente predominante de la matriz de dentina. Soporta la iniciación de calcificaciones, pero no induce la mineralización9. La matriz de colágeno es un soporte atractivo para la ingeniería de tejido pulpar, considerando que el colágeno es uno de los principales componentes de la pulpa dentaria. Sin embargo, por sí misma, no es capaz de inducir la diferenciación odontoblástica de células madre de la pulpa dentaria, lo que indica que los factores morfogenéticos derivados de la dentina son necesarios8. Físicamente, la forma del gel de colágeno, es térmicamente reversible y ofrece propiedades mecánicas limitadas, además es potencialmente inmunógeno7. Sin embargo, el desarrollo de soportes de colágeno recombinante humano es una forma potencialmente segura8. El gel de colágeno está compuesto de combinaciones específicas de secuencias de aminoácidos, que son reconocidas por las células y son degradadas por enzimas secretadas por las células, como, la colagenasa. Las células se unen rápidamente a la matriz de colágeno7.

Los soportes de polímeros naturales de colágeno y también los de glicosaminoglicanos ofrecen buena biocompatibilidad y bioactividad1. El colágeno es comúnmente utilizado como matriz de soporte para cultivar las células en 3D, especialmente en estrategias de ingeniería de tejido10. Dos clases principales de macromoléculas forman la matriz de tejidos blandos, las primeras son principalmente estructuradas de proteínas fibrosas, el colágeno y la elastina, que forman estructuras altamente organizadas e imparten resistencia y estabilidad al tejido natural. La segunda clase de macromoléculas, los glicosaminoglicanos, encontradas en la matriz extracelular del tejido, contienen cadenas de polisacáridos y forma geles altamente hidratados. Los componentes polisacáridos de la matriz extracelular resisten las fuerzas compresivas sobre la matriz, mientras, las proteínas fibrosas proveen resistencia tensional. La comunicación entre las células y la matriz extracelular ocurre vía receptores de la superficie celular, como la integrina, que se une a definidas secuencias de aminoácidos en las moléculas de la matriz11.

Huang, Sonoyama, Chen y Park 10 señalan que la matriz de colágeno puede no ser la más adecuada como soporte para la regeneración del tejido pulpar, por la marcada contracción de la matriz, lo que limita el crecimiento celular al disminuir el volumen. Además, los autores observaron que las células de la pulpa dentaria proliferan en el gel de colágeno, más lentamente que en el cultivo en placas. La determinación del crecimiento de las células de la pulpa en matrices de colágeno es importante para conocer la aplicabilidad del colágeno como matriz, para la ingeniería del tejido pulpar. En otro estudio, Huang y col.12 demostraron, in vivo, en ratones, que cuando las células de la pulpa dentaria se colocan en el gel de colágeno y se introducen en un conducto radicular, la contracción interfería en la regeneración del tejido pulpar. Estas observaciones, también, fueron hechas, in vitro, donde las células y el gel de colágeno obturaban el conducto radicular completo y sufría contracción con el tiempo. Soportes resistentes a la contracción, como el ácido poliláctico-glicólico (PLGA) parece ser un transporte más adecuado para las células de la pulpa. Siete semanas después de sembradas las células madre mesenquimales de la pulpa dentaria sobre soportes PLGA, no mostraron contracción, in vitro, y las células se observaron bien unidas sobre la superficie del soporte. Sin embargo, en un estudio reciente, Rosa y col.8 probaron la conveniencia de los soportes inyectados (Pramatrix™, rhColágeno tipo I) para la ingeniería de tejido pulpar, utilizaron células madre de pulpa de dientes primarios trasplantadas en la longitud completa de conductos radiculares de premolares humanos. Los investigadores observaron la formación de un tejido semejante a la pulpa, capaz de generar nueva dentina.

B) Matrices sintéticas de polímeros: ácido poliláctico (PLA), ácido poliglicólico (PGA) y copolímero ácido poliláctico-glicólico (PLGA)

Las matrices o soportes fabricados de polímeros sintéticos son los más ampliamente utilizados en la ingeniería de tejidos7. Se han investigado como análogos de los elementos estructurales de la matriz extracelular natural, en orden de proporcionar resistencia e integridad estructural en la ingeniería de tejidos. Estos soportes de polímeros sintéticos proveen un mecanismo para el trasplante y localización de las células, definen el espacio potencial para el desarrollo del tejido, proporcionan un soporte mecánico y determinan el grosor morfológico del tejido. Además, estos dispositivos son beneficiosos para la entrega de gran número de células, por su alta porosidad y gran área de superficie. Los macroporos permiten la vascularización y la integración estructural del nuevo tejido con el tejido de origen, que lo rodea seguido del implante11.

Las matrices sintéticas de PLA, PGA y el copolímero PLGA son biocompatibles, presentan adecuadas propiedades físicas (tasa de degradación, resistencia mecánica) y fácil manipulación13. Ellas se degradan por acción del agua del lugar implantado14. Dos tipos estructurales de estos polímeros han surgido para su uso en la ingeniería de tejidos: los soportes basados en fibras y los soportes basados en esponja11.

Los soportes basados en fibras son típicamente compuestos de pequeñas fibras de ácido poliglicólico, de 10 a 15 µm, juntas en un entrelazado o débil entrelazado. Soportes construidos de esta manera son fácilmente conformados en una variedad de formas y se caracterizan por su resistencia bajo cargas tensiónales y debilidad bajo compresión, lo que podría mejorarse con la unión física de otro polímero tal como, el ácido poliláctico. Se ha utilizado con condrocitos y células musculares, in vitro e implantado en modelos animales. Las esponjas altamente porosas también se han utilizado como elementos estructurales de matriz extracelular sintética. Utilizadas en el trasplante de hepatocitos e ingeniería de nuevo tejido semejante al hígado11.

La regulación de la estructura y función del tejido formado a través de la ingeniería de tejidos para su aplicación clínica es crítica. El grosor del tejido puede ser controlado por la estructura de macroporos de la matriz extracelular sintética. Ellos regulan la organización de las células sembradas, las cuales subsecuentemente proliferan y forman nuevo tejido sobre los soportes. La estructura de las matrices extracelulares sintéticas, también regulan la respuesta del tejido del huésped. Por ejemplo, la porosidad y estructura del poro de la matriz extracelular sintética controla la capacidad de los capilares de crecer en esponjas biodegradables de macroporos sembrada con hepatocitos e implantadas, in vivo11.

Putnam y Mooney11 señalan que el tejido formado debe ser inducido a retener u obtener un apropiado patrón de expresión de genes para asegurar funciones propias. La regulación de la expresión de genes del tejido formado puede ser regulada por tres tipos de interacciones con el medio ambiente. El primer tipo de interacción, involucra a factores solubles como, factores de crecimiento y hormonas, que se unen a receptores de la superficie de las células. Este tipo de señalizadores puede ser utilizado en el tejido formado empleando tecnologías que controlen la liberación de drogas. El segundo tipo de interacción, es el de célula-célula que también puede ser manipulada para regular la expresión genética y el tercer nivel de expresión genética celular regulada por manipulación es la adhesión a la superficie de la matriz, interacción célula-matriz.

Para la ingeniería de tejido pulpar, Mooney, Powell, Piana y Rutherford15 utilizaron fibras de matriz sintética de PGA, colocadas en placas de 6 pozos, sembradas con la suspensión celular, cultivadas por 60 días. Las células de la pulpa se unieron a las fibras de la matriz, proliferaron y a los 60 días mostraron un tejido similar al pulpar en términos de apariencia y densidad celular.

C) Soportes cerámicos de hidroxiapatita-fosfato tricalcico (HA-TCP)

La hidroxiapatita es un material biocompatible, su fórmula química es Ca10(PO4)6(OH)2, es el principal componente del hueso y los dientes. Las cerámicas de hidroxiapatita no exhiben efectos tóxicos y son biocompatible con el tejido duro, la piel y el músculo. Desafortunadamente, las cerámicas de hidroxiapatita no pueden ser usadas para soportar cargas pesadas, en el reemplazo de tejido duro16.

Estos soportes se han utilizado para el trasplante de las células madre mesenquimales de la pulpa dentaria en ratones inmunocomprometidos 17-19. El procedimiento consistió en realizar una mezcla con las células madre a una densidad de 5 x 106, 4 x 106 y 2 x 106 con 40 mg de HA-TCP respectivamente y posteriormente trasplantados subcutáneamente en el dorso de ratones inmunocomprometidos, de 10 semanas de edad. Los trasplantes se recuperaron a las 6 semanas. En los trasplantes realizados por Gronthos y col.17,19 se generó una estructura semejante al complejo dentino-pulpar.

Por otra parte, Zhang, Walboomers, Wolke, Bian, Fan y Jansen3 utilizaron soportes estructurales en 3D de HA-TCP, in vitro. Los soportes estructurales tenían una porosidad volumétrica de un 75%, en una relación HA: TCP de 60:40, de forma circular con un diámetro de 6 mm y un espesor de 3 mm. Fueron incubadas en una suspensión celular por 2 horas, luego de cargados los soportes fueron colocados en placas de 24 pozos, con 1 mL de medio inductor odontogénico. Los autores observaron que las propiedades odontogénicas de las células de la pulpa dentaria aisladas de rata fueron soportadas por esta matriz.

Nam, Won, Kim y Kim20 investigaron el uso potencial de soportes estructurales de gránulos porosos de fosfato de calcio (CaP), una matriz tridimensional, en el cultivo de las células madre mesenquimales de la pulpa dentaria humana y la diferenciación odontoblástica. Las células madre mesenquimales de la pulpa dentaria humana fueron aisladas de terceros molares, de pacientes adultos jóvenes. Las células, del tercero y cuarto pasaje, fueron utilizadas para el estudio del crecimiento celular y diferenciación. Los gránulos de 20 mg fueron seleccionados para cubrir completamente la superficie de los pozos. Las células se colocaron en los pozos, en medio α-MEM suplementado con 10% de SFB y 1% de antibiótico-antimicótico. El medio inductor para la diferenciación fue preparado con 10-7 M de dexametasona, 50 µg/mL de ácido ascórbico y 10 mM de ß-GP. La diferenciación fue monitoreada y confirmada con los marcadores de diferenciación DSPP, DMP1, colágeno I y OCN. La determinación de la FA, el análisis Western blot de la DSP, que no fue detectada en cultivo en 2D, sin embargo si fue detectado a los 21 días en el cultivo con gránulos en 3D, que guió a un incremento en su secreción; La prueba de mineralización con coloración Rojo Alizarina S, fue positivo a los 28 días en los gránulos de CaP y solo algunas partes ampliamente coloreadas en el cultivo en 2D. Los autores concluyen que los gránulos en 3D de CaP, pueden ser útiles para la ingeniería de tejido en combinación con las células madre mesenquimales de la pulpa dentaria humana, por que proporcionan condiciones favorables, para el crecimiento celular y desarrollo odontogénico.

D) Malla de fibra de titanio

Zhang, Walboomers, Wolke, Bian, Fan y Jansen3 en su estudio, también utilizaron soportes de malla de fibra de titanio, que consistían en dos capas juntas. El diámetro de la fibra superior de 45 µm y la inferior de 20 µm. Las mallas se prepararon de forma circular con 6 mm de diámetro y 1 mm de espesor. Los autores observaron que la malla de fibra de titanio soportó la adhesión, el crecimiento y la diferenciación de las células de la pulpa dentaria aislada de rata en células semejantes a odontoblastos.

E) Soportes de alginato

El alginato es un conocido biomaterial obtenido del alga marrón y es ampliamente utilizado para la liberación de drogas e ingeniería de tejidos, por su biocompatibilidad, baja toxicidad, relativamente bajo costo y fácil gelación. A pesar, de estas ventajas, el alginato no puede ser un material ideal porque éste se degrada vía un proceso que involucra perdida de iones divalentes en el medio que lo rodea y subsecuentemente disuelto. Este proceso es generalmente incontrolado e impredecible. Otra limitación del gel de alginato es su imposibilidad para interactuar con las células de mamíferos. Actualmente se ha modificado y mejorando sus propiedades7.

Fujiwara, Kumabe e Iwai6 utilizaron el alginato como un soporte para el trasplante de células derivadas de la pulpa dentaria de ratas, en la espalda desnuda de ratón. Los autores pudieron observar la diferenciación de estas células en células semejantes a odontoblastos e indujo la formación de calcificaciones radiopacas, in situ, después de 6 semanas del trasplante. Los autores concluyen que el soporte de alginato soporta la diferenciación de las células cultivadas en trasplantes.

Zhang, Walboomers, van Kuppevelt, Daamen, Bian y Jansen21 investigaron, in vitro e in vivo, el comportamiento de las células madre mesenquimales de la pulpa dentaria humana, sembradas sobre soportes estructurales de diferentes materiales: esponjas colágenas, cerámica porosa de HA-TCP y malla de fibras de titanio. El primer grupo, fue cultivado, in vitro, por 4 semanas. El segundo grupo, fue implantado subcutáneamente en ratones por 6 a 12 semanas. Las muestras cultivadas, in vitro, desarrollaron abundante depósito de matriz extracelular mineralizada, con expresión de DSPP en los 3 materiales. Los implantes mostraron formación de tejido positivo a DSPP en todos los materiales de soportes. Sin embargo, el aspecto del tejido formado en los tres tipos de soportes parecía más como tejido conectivo que tejido semejante a dentina. Limitadas calcificaciones de la matriz extracelular se observaron solo en los soportes de cerámica. Los autores señalan que junto a la selección de las células, la selección del material del soporte estructural es fundamental para la regeneración del tejido dentario.

El objetivo del presente trabajo de investigación es determinar la capacidad de diferenciación in vitro de las células madre mesenquimales adultas de la pulpa dentaria humana hacia el linaje odontogénico, con el uso de factores inductores en el medio y una matriz tridimensional de colágeno tipo I.

MATERIALES Y MÉTODOS

AISLAMIENTO Y CULTIVO DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA

El protocolo para el aislamiento se basa en la capacidad de las células madre mesenquimales de adherirse a los discos de cultivo y formar grupos discretos de colonias. Para aislar las células, el tejido pulpar se colocó en una mezcla de solución enzimática de 4 mg/mL de colagenasa tipo I (SIGMA) y 2 mg/mL de dispasa (GIBCO™), en una proporción 1:1 por sesenta minutos a 37°C22. La suspensión obtenida, conteniendo las células aisladas, se filtró a través de un filtro de células de 70 μm, para separar el tejido pulpar disgregado del no disgregado. Posteriormente, la suspensión celular resultante se centrifugó durante seis minutos a 500g. Luego el taco celular obtenido, se resuspendió en el medio nutritivo para células mesenquimales, compuesto por: el medio DMEM-F12 suplementado con 15% de SFB (GIBCO™) 100 μM L-ácido ascórbico 2-fosfato (Merck), 2 mM L-glutamina (Glutamax; GIBCO®), 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y 2 µg/mL de anfotericina B (GIBCO®), y fueron sembradas en placas de 4 pozos (NUNC; 1,9 cm2 cada pozo). Las células aisladas de la pulpa dentaria, generalmente, son sembradas a una densidad de 0,1 a 1 x 103 células/cm2 22. En el presente trabajo se sembraron a una densidad que varió entre 1 x 103 y 104 / cm2. La viabilidad celular se determinó con el colorante de exclusión Azul Tripano y se cuantificó el número de células con un hemocitómetro (Cámara Neubauer). Los cultivos fueron incubados a 37°C, en atmósfera húmeda a 95% de aire y 5% de CO2.

A las veinticuatro a cuarenta y ocho horas se cambió el medio de cultivo, previo lavado con PBS, para así eliminar los restos de células y células no adherentes23. Las células se mantuvieron hasta alcanzar la semiconfluencia (80%), con cambios periódicos de medio. Obtenida la semiconfluencia, se procedió a realizar los subcultivos con el fin de amplificar la población de las células; para ello las células se disgregaron con 0,05% de tripsina (GIBCO™) y 0,2% de EDTA (SIGMA®), incubadas por siete minutos a 37°C, transcurrido este tiempo se añadió medio nutritivo suplementado con suero para inactivar la tripsina. Las células fueron centrifugadas a 500 g por seis minutos y el taco celular obtenido se resuspendió en 0,5 a 1 mL de medio de cultivo nutritivo con suero, luego las células fueron contadas en una cámara de Neubauer para sembrar nuevamente. Las células obtenidas de los subcultivos se utilizaron para los ensayos de caracterización morfológica, expresión de marcadores antigénicos de superficie celular, eficiencia de formación de colonias, proliferación celular e inducción a la diferenciación24-26.

PREPARACIÓN DE LA MATRIZ TRIDIMENSIONAL NATURAL DE COLÁGENO TIPO I

La preparación de la matriz tridimensional natural de colágeno tipo I, a partir de la cola de rata, se llevó a cabo de la siguiente manera: la cola de la rata fue separada y disectada eliminando la piel y luego se incubó en etanol al 70% por una hora, seguido de esto se transfirió a PBS por treinta minutos y se cortó en 4 partes y se colocaron en PBS por treinta minutos y se procedió a la extracción de los tendones. Se realizó una estimación de la concentración del colágeno, se pesaron en gramos los tendones, estos se colocaron en una placa de Petri seca, estéril y prepesada. Por cada 0,5 gramos de tejido pesado se colocaron 100 mL de ácido acético a 0,01%, se dejaron en agitación continua por cuarenta y ocho horas a 4°C. Finalmente, el extracto obtenido se centrifugó a 1.304,1 g por cuarenta y cinco minutos a 4°C. El stock de colágeno a 0,5% se mantuvo a 4°C, hasta su utilización. El pH de la solución de colágeno fue ajustado a 7,4 con hidróxido de sodio27.

DIFERENCIACIÓN ODONTOGÉNICA-OSTEOGÉNICA DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA EN MATRICES DE GEL DE COLÁGENO TIPO I

Las células de 1 línea celular (1 paciente), se sembraron en matrices de gel de colágeno, de dos maneras:

  1. Células inmersas en la matriz natural de colágeno tipo I
  2. Se preparó una solución con: 4 partes de colágeno tipo I, 1 parte de medio 10 X DMEM y 1 parte de suspensión celular28 (90.000 células resuspendidas en 200 µL de SFB). En cada pozo de 1,9 cm2 de las placas de 4 pozos, se depositaron 0,468 mL de solución de colágeno y se dejó polimerizar a 37 °C, por una hora, después de lo cual se añadió 0,25 mL de medio suplementado con 10 mM β-GP, 10-8 M dexametasona y 50 μg/mL ácido L-ascórbico29. Las células colocadas en la solución de colágeno quedaron inmersas en el gel.

  3. Células sobre la matriz natural de colágeno tipo I
  4. Se preparó una solución con: 4 partes de colágeno tipo I, 1 parte de medio 10 X DMEM. En cada pozo, de las placas de 4 pozos (1,9 cm2), se depositaron 0,468 mL de solución de colágeno y se dejó polimerizar a 37 °C, por una hora. Posteriormente, la suspensión celular (90.000 células resuspendidas en 200 µl de SFB), se sembró sobre la matriz de gel de colágeno polimerizada. Después de lo cual se añadió 0,25 mL de medio suplementado con 10 mM β-GP, 10-8 M dexametasona y 50 μg/mL ácido L-ascórbico. Las muestras fueron analizadas a los catorce y veintiún días. Como control, las células fueron cultivadas en el gel de colágeno sin medio inductor28.

EVALUACIÓN DE LA DIFERENCIACIÓN ODONTOGÉNICA DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA

Pocos estudios han evaluado la diferenciación odontogénica de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana en matrices de gel de colágeno tipo I. En la presente investigación la diferenciación odontogénica fue evaluada por las características morfológicas de las células mediante coloración de rutina Hematoxilina–Eosina. La expresión de la Sialoproteína Dentinaria (DSP) por medio del análisis inmunocitoquímico y la formación de nódulos de calcificación que se realizó con la coloración histoquímica de depósitos de fosfato de calcio, Rojo Alizarina30, a los catorce y veintiún días de inducción. Las muestras se prepararon para seccionamiento y coloración, por fijación con una solución al 10% de formalina en PBS y embebida en parafina. Se cortaron secciones de 5 µm, utilizando técnicas corrientes de histología28. Los registros fueron realizados en un microscopio invertido (Olympus I X50) acoplado a una computadora con programa TV Tuner.

RESULTADOS

  1. Células inmersas en la matriz natural de colágeno tipo I
  2. Caracterización morfológica. Las células inmersas en la matriz de colágeno tipo I, a los catorce días, en el cultivo “control” mostraron una morfología redondeada y ovalada, con un núcleo excéntrico, basófilo y con un citoplasma claro. En el cultivo “inducido a la diferenciación odontogénica-osteogénica” , las células conservaron la morfología redondeada y ovalada, sin embargo, el núcleo se observó más basófilo y el citoplasma menos claro, se ve mayor número de células y la matriz de colágeno se observa más marcada y fibrosa (Figura 1B y C). A los veintiún días, el cultivo “control” se observó muy semejante al cultivo “inducido” a los catorce días, mientras, que en el cultivo “inducido a la diferenciación” se observó mayor número de células y se evidencia la interacción entre las células y las células y la matriz. La matriz se observa más marcada y fibrosa, como una red. Figura 1D y E.

    FIGURA 1. Células mesenquimales de la pulpa dentaria humana inmersas en la matriz de colágeno tipo I
    FIGURA 1. Células mesenquimales de la pulpa dentaria humana inmersas en la matriz de colágeno tipo I. A. Tres días de cultivo, células viables, la mayoría con morfología redondeada. 100x. Contraste de fase. Catorce y veintiún días de inducción a la diferenciación odontogénica-odontogénica. Coloración Hematoxilina-Eosina. Catorce días: B. Cultivo “control”, las células muestran una morfología redondeada y ovalada, núcleo excéntrico y basófilo y citoplasma claro. 400x. C. Cultivo “inducido a la diferenciación”, mayor número de células, con morfología redondeada y ovalada, núcleo excéntrico, fuertemente basófilo y citoplasma menos claro. La matriz se observa más densa y fibrosa. Veintiún días: D. Cultivo “control”, semejante al cultivo “inducido” a los catorce días. E. Cultivo “inducido a la diferenciación”, las células interactúan con la matriz y con otras células. La matriz se observa más fibrosa, como una red. 400x

    Expresión inmunohistoquímica de la DSP. A los catorce días, en el cultivo “control” y los cultivos “inducidos a la diferenciación” no se evidenciaron cambios morfológicos, las células se observaron redondeadas y algunas expresaron la DSP. A los veintiún días, en el cultivo “control” las células se observaron redondeadas y algunas expresaron la DSP (Figura 2A); en los cultivos “inducidos a la diferenciación”, se observan células con cambios morfológicos, a una forma más ovalada, que expresaron claramente la DSP. La matriz mostró cambios, se observó más fibrosa. Figura 2B, C y D.

    FIGURA  2. Células mesenquimales de la pulpa dentaria humana inmersas en la matriz natural de colágeno tipo I, a los veintiún días de inducción odontogénica-osteogénica.
    FIGURA 2. Células mesenquimales de la pulpa dentaria humana inmersas en la matriz natural de colágeno tipo I, a los veintiún días de inducción odontogénica-osteogénica. Expresión de la DSP, análisis inmunohistoquímico. A. Cultivo “control”, las células permanecen redondeadas, algunas células expresan la DSP (flecha negra). 400x. B. C. y D. Cultivo “Inducido a la diferenciación”, las células (flechas negras) y la matriz (*) expresan la DSP, se observan cambios morfológicos (flechas azules) y la matriz muestra cambios notables, se observa más fibrosa. 400x

    Formación de nódulos de calcificación

    A los catorce días, no se pudo evidenciar la presencia de nódulos calcificados, se observaron muy pocas células. A los veintiún días, en el cultivo “control” se observaron pocas células y poca matriz coloreada con Rojo Alizarina; en el cultivo “inducido a la diferenciación odontogénica-osteogénica” por el contrario, se observó la formación de numerosos nódulos calcificados y células rodeadas de zonas difusas de calcificación. Figura 3

    FIGURA 3.  Células mesenquimales de la pulpa dentaria humana inmersas en la matriz de colágeno tipo I, veintiún días de inducción odontogénica-osteogénica. Coloración histoquímica con Rojo Alizarina.
    FIGURA 3. Células mesenquimales de la pulpa dentaria humana inmersas en la matriz de colágeno tipo I, veintiún días de inducción odontogénica-osteogénica. Coloración histoquímica con Rojo Alizarina. A. Cultivo “control”, pocas células rodeadas de matriz. 100x. B. Cultivo “inducido a la diferenciación”, se observan numerosas nódulos calcificados inmersos en la matriz. 100x. C. Mayor aumento, se observan nódulos calcificados y zonas difusas de mineralización. 200x. D. Mayor aumento, células rodeadas de matriz mineralizada de fosfato de calcio. 400x
  3. Células sobre la matriz natural de colágeno tipo I
  4. Caracterización morfológica. Células de morfología fusiforme (Figura 4B) mostraron cambios morfológicos que se evidenciaron desde los catorce días de la “inducción a la diferenciación odontogénica-osteogénica” (Figura 4C). A los veintiún días en el cultivo “control” también se observaron cambios morfológicos (Figuras 4E y F), mientras, en los cultivos “inducidos” a la diferenciación se observó mayor número de células con cambios morfológicos, las células se observan polarizadas, con prolongación citoplasmática, semejante a odontoblastos. Además, se observa un marcado cambio en la matriz extracelular, se observa fibrosa y densa. Figuras 4G, H, I y J

    FIGURA 4. Células mesenquimales de la pulpa dentaria humana sobre la matriz de colágeno tipo I.
    FIGURA 4. Células mesenquimales de la pulpa dentaria humana sobre la matriz de colágeno tipo I. A. Tres días de cultivo, células viables, con morfología fusiforme. 100x. Contraste de fase. Catorce y veintiún días de inducción odontogénica-osteogénica. Coloración Hematoxilina-Eosina. Catorce días: B. Cultivo “control”, célula fusiforme (*). 400x. C. Cultivo “inducido a la diferenciación”, células con cambios morfológicos. 400x. Veintiún días: Cultivo “control”: D. Células sobre la matriz. 40x. E. Células fusiformes (*) y otras con cambios morfológicos (flecha). 400x. F. Algunas células polarizadas, (flechas). 400x. Cultivo “inducido a la diferenciación”: G. Células sobre la matriz y algunas incluidas con cambios morfológicos. 100x. H. I. y J. Células polarizadas con prolongación citoplasmática, semejantes a odontoblastos (flechas), la matriz se observa fibrosa y densa (*). 400x

    Expresión inmunohistoquímica de la DSP. A los catorce días, en el cultivo “control” se observaron muy pocas células y algunas expresaron la DSP (Figura 5A). En el cultivo “inducido” a la diferenciación se observaron pocas células, algunas expresaron la DSP y mostraron cambios morfológicos (Figura 5B). A los veintiún días, el cultivo “control” mostró pocas células, algunas con cambios morfológicos y expresión de la DSP semejante al cultivo inducido a los catorce días (Figura 5C y D). En el cultivo “inducido a la diferenciación” las células mostraron una expresión de moderada a intensa de la DSP, con cambios morfológicos, algunas semejantes a odontoblastos, células polarizadas con prolongación citoplasmática. Algunas células parecieran haber migrado hacia el interior de la matriz de colágeno. Además, se pudo notar que la matriz extracelular parecía más densa y fibrosa en algunas zonas. Figura 5E, F, H, I, J, K y L

    FIGURA 5. Células mesenquimales de la pulpa dentaria humana sobre la matriz de colágeno tipo I, catorce y veintiún días de inducción odontogénica-osteogénica.
    FIGURA 5. Células mesenquimales de la pulpa dentaria humana sobre la matriz de colágeno tipo I, catorce y veintiún días de inducción odontogénica-osteogénica. Expresión de la DSP, análisis inmunohistoquímico. Catorce días: A. Cultivo “control”, muy pocas células, se observó expresión de la DSP.100x. B. Cultivo “inducido a la diferenciación”, células con cambios morfológicos que expresan la DSP, (flecha). 400x. Veintiún días: C. Cultivo “control”, se observa la matriz con pocas células. 40x. D. Mayor aumento, células con cambios morfológicos y expresión de la DSP, (flecha). 400x. E, F, G, H, I, J, K, y L. Cultivo “inducido a la diferenciación”, células con cambios morfológicos que expresan la DSP (flechas). La matriz se observa densa y fibrosa.400x

    Formación de nódulos de calcificación. A los catorce días, en el cultivo “control” se observaron muy pocas células y solo se observó una pequeña zona coloreada (Figura 6A) mientras, en el cultivo “inducido” se observaron algunos nódulos pequeños (Figura 6B). A los veintiún días, el “control” mostró la presencia de algunos pequeños nódulos (Figura 6C), mientras, en el cultivo “inducido” hubo formación de numerosos nódulos calcificados Rojo Alizarina “positivos”. Figura 6D, E y F.

    FIGURA 6.  Células mesenquimales de la pulpa dentaria humana sobre  la matriz de colágeno tipo I, catorce y veintiún días de inducción odontogénica-osteogénica.
    FIGURA 6. Células mesenquimales de la pulpa dentaria humana sobre la matriz de colágeno tipo I, catorce y veintiún días de inducción odontogénica-osteogénica. Coloración histoquímica con Rojo Alizarina. Catorce días: A. Cultivo “control”, muy pocas células, una zona pequeña con marcaje.100x B. Cultivo “inducido”, se observan algunos pequeños nódulos calcificados. 200x. Veintiún días: C. Cultivo “control”, algunas zonas Rojo Alizarina “positivas”. 100x. D. y E. Cultivo “inducido”, numerosos nódulos calcificados. 100x. F. Mayor detalle, células rodeadas de matriz mineralizada de fosfato de calcio. 400x

    DISCUSIÓN

    El objetivo del presente trabajo de investigación fue determinar la capacidad de diferenciación in vitro de las células madre mesenquimales adultas de la pulpa dentaria humana hacia el linaje odontogénico, con el uso de factores inductores en el medio y una matriz tridimensional de colágeno tipo I

    Para “inducir la diferenciación odontogénica”, se utilizó un sustrato tridimensional, una matriz de colágeno natural tipo I, las células se sembraron inmersas en la matriz y sobre la matriz. Zhang y col.21 en su estudio, demostraron que la matriz de colágeno soporta la diferenciación y la formación de abundantes calcificaciones. El colágeno es un componente predominante de la matriz de la dentina y soporta la iniciación de la calcificación, sin embargo, no induce la mineralización, por si misma, requiere la presencia de factores morfogénicos8, además, tiene la ventaja de ser citocompatible y bioactivo4.

    Huang, Sonoyama, Chen y Park10 señalan que la determinación del crecimiento de las células de la pulpa en matrices de colágeno es importante para conocer la aplicabilidad del colágeno como matriz, en estrategias de ingeniería del tejido pulpar. No obstante, en el presente trabajo no se llevó a cabo el contaje celular para evaluar la proliferación celular, sería conveniente realizar esto en próximos estudios. Sin embargo, si se pudo observar, de una manera cualitativa, una menor cantidad de células comparado con las células cultivadas en el sustrato plástico bidimensional26. Los autores10 también, pudieron notar que las células de la pulpa dentaria proliferan en el gel de colágeno, mucho más lentamente que en el cultivo en placas. Por su parte, Bohl y col.28 observaron que las células sembradas inmersas en el gel de colágeno por 42 días revelaron un tejido con una baja celularidad, las células formaron una monocapa sobre el exterior de la matriz de colágeno y muy pocas células fueron visibles en el interior de la matriz. Las células no fueron distribuidas uniformemente en la matriz del gel de colágeno. No es claro si fue el resultado de la migración de las células del interior a la superficie o una diferencia de crecimiento de las células en el interior versus la superficie del gel de colágeno. Mientras que, las células sobre una capa de colágeno exhibieron un rápido crecimiento y proliferación. En el presente estudio, también, se pudo evidenciar una tendencia de las células a ubicarse hacia la superficie de la matriz y la presencia de pocas células. Mientras que, las células sembradas sobre la matriz de colágeno mostraron, cualitativamente, un mayor número de células.

    Huang, Sonoyama, Chen y Park 10 consideran que la matriz de colágeno puede no ser la más adecuada como soporte para la regeneración de tejido pulpar, por la marcada contracción de la matriz, causada por las células de la pulpa al proliferar, que limita el crecimiento celular al disminuir el volumen. Bohl, Shon, Rutherford y Mooney28 también, describen que el crecimiento celular en el gel de colágeno fue acompañado por la contracción del gel. Quizás la utilización de un soporte resistente a la contracción, como el PLGA, sería más adecuada10, además, este soporte guía al desarrollo de un tejido con alta celularidad28. En el presente estudio sin embargo, no se evaluó la contracción de la matriz.

    Sin embargo, Rosa, Zhang, Grade y Nör 8 inyectaron células madre de pulpa de dientes primario resuspendidas en soportes de colágeno tipo I, en la longitud completa de conductos radiculares y observaron que las células sobrevivieron y se diferenciaron en odontoblastos capaces de formar dentina. El número de células se incrementó cuatro veces. La expresión de DSPP se inició a los catorce días y a los veintiocho días fue claramente expresada, in vitro. in vivo, se formó un tejido semejante al tejido pulpar capaz de generar dentina.

    Cuando las células se sembraron inmersas en la matriz de colágeno se observó que ellas no se expandían, sino, permanecieron redondeadas, mientras, que cuando se sembraron sobre la matriz de colágeno, las células mostraron una morfología semejante a los fibroblastos, que luego de la “inducción odontogénica” algunas células cambiaron hacia una morfología semejante a odontoblastos, se observó la expresión de la DSP y la formación de depósitos calcificados Rojo Alizarina “positivos”, sugerentes a una diferenciación odontoblástica en ambos métodos, especialmente a los veintiún días de la inducción.

    Resulta interesante señalar que en el presente estudio, in vitro, no se observó una organización espacial similar a la zona de odontoblastos, cuando las células se sembraron en la matriz de colágeno tipo I. Quizás las células requieren más tiempo para organizarse espacialmente. Sería de gran interés evaluar la diferenciación a los treinta y sesenta días. También, se podría pensar en la necesidad de condiciones de crecimiento con múltiples señales moleculares o factores de crecimiento necesarios para la proliferación y diferenciación como lo describen Yu, Deng, Shi, Zhai, Nie, Zhang, Li y Jin31 Por otro lado, Liu, Li, Gao, Kumagai, Blacher y DenBesten32 señalan que la dentinogénesis es un prerrequisito necesario para la ingeniería de tejido dentario y uno de los pasos es la obtención de gran cantidad de odontoblastos altamente purificados. Se sugiere más investigación para determinar el comportamiento de las células mesenquimales aisladas y cultivadas en esta matriz de colágeno tipo I.

    Los resultados de la “inducción a la diferenciación odontogénica” en sustrato bidimensional26 y tridimensional (matriz de colágeno) demuestran que en ambos sustratos se logró la diferenciación hacia el linaje odontogénico a los catorce y veintiún días de inducción, siendo esta más evidente y clara a los veintiún días de inducción. Los resultados en el sustrato bidimensional y el sustrato tridimensional (células sembradas sobre la matriz de colágeno) mostraron similitud a nivel de los cambios morfológicos, expresión de DSP y formación de nódulos mineralizados.

    CONCLUSIÓN

    Las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana aisladas e inducidas a la diferenciación odontogénica-osteogénica en sustrato tridimensional (matriz de colágeno) lograron diferenciarse en células semejantes a odontoblastos.

    Referencias bibliográficas

    1. Nakashima M, Akamine A. The application of tissue engineering to regeneration of pulp and dentin in endodontics. J Endod 2005; 31(10): 711- 715.
    2. Shen CN, Horb ME, Slack JMW, Tosh David. Transdifferentiation of pancreas to liver. Mech of Dev 2003; 120: 107- 116.
    3. Zhang W, Walboomers XF, Wolke JGC, Bian Z, Fan MW, Jansen JA. Differentiation Ability of rat postnatal dental pulp cells in vitro. Tissue Eng 2005; 11(3/4): 357- 368.
    4. Mauth C, Huwig A, Graf-Hausner U, Roulet J-H. Restorative applications for dental pulp therapy. Topics in Tissue Engineering 2007; 3. Eds Ashammakhi N, Reis R, Chiellini E©.
    5. Govindasamy V, Ronald VS, Totey S, Din SB, Mustafa WM, Totey S, Zakaria Z Bhunde RR. Micromanipulation of culture niche permits long term expansion of dental pulp stem cells an economic and commercial angle. in vitro Cell Dev Biol-Animal 2010. DOI: 10.1007/s11626-010-9332-0. Fecha de consulta, Abril 2, 2011.
    6. Fujiwara S, Kumabe S, Iwai Y. Isolated rat dental pulp cell culture and trasplantation with an alginate scaffold. Okajimas Folia Anat Jpn 2006; 83(1): 15- 24.
    7. Lee KY, Mooney DJ. Hydrogels for tissue engineering. Chem Rev 2001; 101(7): 1869- 1879.
    8. Rosa V, Zhang Z, Grade RHM, Nör JE. Dental pulp tissue engineering in full length human root canals. J Dent Res 2013; 92 (11): 970- 975.
    9. Batouli S, Miura M, Brahim J, Tsutsui TW, Fisher LW, Gronthos S, Robey PG, Shi S. Comparison of stem cell mediated osteogenesis and dentinogenesis. J Dent Res 2003; 82(12): 976- 981.
    10. Huang G TJ, Sonoyama W, Chen J, Park SH. in vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell Tissue Res 2006; 324: 225- 236.
    11. Putnam AJ, Mooney DJ. Tissue engineering using synthetic extracelular matrices. Nat Med 1996; 2(7): 824- 826.
    12. Huang GTJ, Sonoyama W, Liu Y, Liu H, Wang S, Shi S. The hidden treasure in apical papilla: the potential role in pulp/dentin regeneration and bioroot engineering. J Endod 2008; 34(6): 645- 651.
    13. Grottkau BE, Purudappa PP, Lin Y. Multilineage differentiation of dental pulp stem cells from green fluorescent protein transgenic mice. Int J Oral Sci 2010; 2(1): 21- 27. http://www.ijos.org.cn. doi: 10.4248/IJOS10015. Feha de consulta, Marzo 2010.
    14. Jo YY, Lee HJ, KooK SY, Choung HW, Park JY, Chung JH, Choung YH, Kim ES, Yang HC, Choung PH. Isolation and characterization of postnatal stem cells from human dental tissues. Tissue Eng 2007; 13(4): 767- 773.
    15. Mooney DJ, Powell C, Piana J, Rutherford B. Engineering dental pulp like tissue in vitro. Biotechnol Prog 1996; 12: 865- 868.
    16. Suchanek W, Yoshimura M. Processing and properties of hydroxypatite-based biomaterials for use hard tissue replacement implants. J Mater Res 1998; 13(1): 94- 1.
    17. Gronthos S, Mankani M, Brahim J, Gehron P, Shi S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97(25):13625- 13630.
    18. Miura M, Gronthos S, Zhao M, Lu B, Robey LW, Shi S. SHED: Stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proc Natl Acad Sci USA 2003 May 13; 100(10): 5807- 5812.
    19. Gronthos S, Brahim J, Li W, Fisher, Cherman N, Boyde A, DenBesten P, Gehron Robey P, Shi S. Stem cell properties of human dental pulp stem cell. J Dent Res 2002; 81(8): 531- 535.
    20. Nam S, Won JE, Kim CH, Kim HW. Odontogenic differentiation of human dental pulp stem cells stimulated by the calcium phosphate porous granules. J Tissue Eng 2011. Article ID 812547, 10 pages. DOI: 10.4061/2011/812547. Fecha de consulta, Abril 2, 2011.
    21. Zhang W, Walboomers XF, van Kuppevelt TH, Daamen WF, Bian Z, Jansen JA. The performance of human dental pulp stem cells on different three-dimensional scaffold materials. Biomaterials 2006; 27: 5658- 5668.
    22. Sonoyama W, Yamaza T, Gronthos S, Shi S. Multipotent stem cells in dental pulp. En Freshney RI, Stacey GN, Auerbach JM editors. Culture of human stem cells. Wiley, New Jersey 2007:187- 206.
    23. Mohd AB, Fazliah SN, Fadilah A, Asma H, Siti AR, Shaharum S, Jaafar S, Asiah AB, Shamsuria O. Stem cells from childrens´teeth. Archs Oral Sciences 2008: 3(1); 29- 31.
    24. Camejo M, Merentes E, Márquez L, González O. Aislamiento y caracterización de las células madre mesenquimales de la pulpa dentaria humana. Acta Odontológica Vol. 51 Nº 3 Año 2013.
    25. Camejo M, Merentes E. Establecimiento y cultivo, eficiencia de formación de colonias y proliferación celular de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana. Acta Odontológica Vol. 51 Nº 4 Año 2013.
    26. Camejo M, Merentes E, Payares G, Márquez L, Espinoza M. Aislamiento, cultivo y diferenciación in vitro de células madre mesenquimales adultas de pulpa dentaria humana. Acta Odontológica Vol. 53 Nº 1 Año 2015.
    27. Acosta AC. Cultivo de células del estroma de la médula ósea de rata y su potencial de diferenciación in vitro. Trabajo Especial de Grado 2003. Departamento de Zoología. Escuela de Biología. Facultad de Ciencias Universidad Central de Venezuela. Caracas.
    28. Bohl K, Shon J, Rutherford B, Mooney DJ. Role of synthetic extracellular matrix in development of engineered dental pulp. J Biomater Sci Polymer Edn 1998; 9(7): 749- 764.
    29. Huang AHC, Chen YK, Chan AWS, Shieb TY, Lin LM. Isolation and characterization of human dental pulp stem/stromal cells from nonextracted crown-fractured teeth requiring root canal therapy. J Endod 2009; 35(5): 673- 681.
    30. Mc Gee-Russell SM. Histochemical methods for calcium. J Histochem Cytochem 1958; 6: 22. Tomado de: Prophet EB, Mills B, Arrington JB, Sabin LH. Métodos Histotecnológicos. Instituto de Patología de las Fuerzas Armadas de los Estados Unidos de America (AFIP); 1995. P 270.
    31. Yu J, Deng Z, Shi J, Zhai H Nie X, Zhang H, Li Y, Jin Y. Differentiation of pulp stem cells into regular-shaped dentin-pulp complex induced by tooth germ cell conditioned medium. Tissue Eng 2006; 12(11):3097- 3105.
    32. Liu H, Li W, Gao C, Kumagai Y, Blacher RW, DenBesten PK. Dentonin, a fragment of MEPE, enhanced dental pulp stem cell proliferation. J Dent Res 2004; 83(6): 496- 499.