Trabajo Original

Estudio de la regeneración ósea en un modelo animal utilizando una membrana a base de quitosano y nanohidroxiapatita

Recibido para arbitraje: 25/06/2017
Aprobado para su publicación: 03/07/2017

Villarroel-Dorrego Mariana1, Granadillo Karla1, Velazco Gladys2, Martínez Juan Carlos3, Ortiz Reynaldo4

Resumen

El objetivo de estainvestigación fue determinar el efecto de una membrana de quitosano (Qt) e hidroxiapatita (HA) en el proceso de regeneración ósea en un modelo animal.Metodología: Fue realizada una investigación experimental usando 27 ratas de la cepaWistar, a las cuales se les realizó un defecto óseo en cada tibia. Fue confeccionada eimplantada una membrana de Qt/HA en el defecto de una de las tibias de cada animal. Las ratas fueron sacrificadas al mes y 3 mesespostquirúrgicos. Se realizó evaluación imagenológica, histológica y ultraestructural de lastibias extraídas. Las variables fueron comparadas mediante los test de t student y chi2.Valores p‹0.05 fueron considerados estadísticamente significativos. Resultados:Radiográficamente, tanto al mes como 3 meses postoperatorios, no se observarondiferencias estadísticamente significativas entre las densidades óseas de las tibias control yexperimental. Histológicamente, a los 3 meses, las tibias experimentalesmostraron una mayor formación de tejido óseo (p= 0,011). Se observó además la presencia del material, tanto al mes y como a los 3 meses, (80% y 86,6 % respectivamente). La evaluación ultraestructuraldemostró una importante bioactividad del biomaterial con el tejido óseo circundante.Conclusión: El biomaterial desarrollado fue de sencilla elaboración, viable, accesibleeconómicamente, de fácil manipulación y tolerable para los animales. Su biodegradabilidadfue lenta y se demostró que interactúa positivamente con el tejido óseo, acelerando elproceso de neoformación ósea a los 3 meses postoperatorios.

Palabras clave: regeneración ósea, quitosano, biomateriales.


Original work

Study of bone regeneration in an animal model using a chitosan-nanohydroxyapatite membrane

Abstract

The aim of this study was to determine the effect of a membrane based on chitosan and hydroxyapatite in bone regeneration in an animal model. Methods: An experimental study using 27 Wistar rats was performed. A bone defect was created in both tibias and a membrane of chitosan and hydroxyapatite was created and placed in the bone defect of one of the tibias of each animal. Rats were sacrificed after 1 month and other group after 3 month after surgery. Radiologic, histological and ultrastructural analysis was completed. Variables were compared using t student and chi2 tests. Significance level was set at 0.05 (α=0.05) and pvalues‹0.05 were considered statistically significant. Results: No difference was observed after 1 and 3 months in tibia x-rays. Material presence was observed after 1 month (80% cases) and 3 months (86% cases) of placement. Bone formation after one month was similar in both tibias, however, after 3 months experimental tibias showed an histological increase bone formation (p= 0,011). Ultraestructural analysis corroborated bone formation and high bioactivity of the material. Conclusion: Membranes made of chitosan and hydroxyapatite were a cheap, easy and biotolerant material alternative used. Slow biodegradation of the membrane was demonstrated to improve bone formation after 3 months of placement.

Key words: bone regeneration, chitosan, biomaterials.


  1. Instituto de Investigaciones Odontológicas, Universidad Central de Venezuela. Venezuela.
  2. Instituto de Investigaciones Odontológicas, Universidad de los Andes. Venezuela.
  3. Facultad de Odontología, Universidad Central de Venezuela.
  4. Laboratorio de Análisis Químico y Estructural de Materiales (LAQUEM), de la Universidad de Los Andes. Venezuela.
  5. Autor de correspondencia:
    Mariana Villarroel Dorrego. Instituto de Investigaciones Odontológicas, Facultad de Odontología.
    Universidad Central de Venezuela. Ciudad Universitaria, Los Chaguaramos. Caracas 1060, Venezuela. mariana.villarroel@ucv.ve

Introducción

La regeneración tisular es un proceso por el cual el tejido originado es estructural y funcionalmente idéntico al tejido inicial1. El hueso es un tejido capaz de regenerarse a sí mismo de manera completa a través de la reactivación de los procesos que tienen lugar durante su embriogénesis1. Cuando el tejido óseo sufre una fractura, se pone en marcha un proceso que conduce a la reposición de la estructura y funciones perdidas2.

Hoy día, muchos sustitutos óseos y biomateriales son utilizados ampliamente en la práctica clínica como complementos o alternativas al hueso autólogo, ya que promueven la migración, proliferación y diferenciación celular para la regeneración ósea, especialmente para la regeneración de defectos óseos grandes, donde el requisito de un material que sirva como injerto es sustancial3. Conceptualmente un biomaterial es una sustancia o una combinación de sustancias que puede ser usada por un período de tiempo como un todoo formando parte de un sistema que aumenta o sustituye un tejido, órgano o función del cuerpo4. En sentido práctico, los principales biomateriales sonlos injertos óseos, los metales, los polímeros, las cerámicas; todos éstos son fabricados o procesados para adaptarlos a su adecuado uso como un dispositivo médico que entrará en íntimo contacto con las proteínas y células de los órganos y tejidos del cuerpo.

La hidroxiapatita (HA) es un biomaterial conformado por fosfato de calcio que se puede obtener de forma sintética y presenta características debiocompatibilidad, no toxicidad, estabilidad química, osteoconducción y bioactividad, las cuales hacen al material muy útil para usos biomédicos5. Los implantes de cerámica para regeneración están básicamente hechos de HA, estos andamios tienen alta porosidad y tienen una importante propiedad ostoconductora6. Las combinaciones de cerámica también han sido exploradas, un ejemplo es la cerámica bifásica (fosfato tricálcico más HA). Dentrode las desventajas asociadas a su uso, se encuentra la alta tasa de fragilidad y su lentadegradación7.

En los últimos tiempos se ha prestado especial atención al quitosano (Qt), un derivado de laquitina, de alto peso molecular que constituye uno de los biopolímeros naturales másabundantes en la naturaleza. Las principales fuentes de obtención son los caparazones de cangrejo, camarón, langostino y langosta. El Qt es unpolisacárido lineal que se obtiene por desacetilación extensiva de la quitina. Está compuesto por amino azúcares unidos entre sí por enlacesglicosídicos β formando una cadena lineal de unidades de N-acetil-2-amino-2-desoxi-Dglucosa8.

El Qt es un polímero biocompatible y biodegradable, que promueve la adhesión celular y esreabsorbido por medio de la hidrólisis por enzimas presentes en los fluidos9. Posee propiedades hemostáticas y protege las superficies cruentas, es flexibley adhesivo, por lo tanto es un excelente material para aplicaciones biomédicas, especialmente en el área de la regeneración ósea9,10.

A pesar de todas las cualidades mencionadas, el Qt muestra pobres propiedades mecánicas, lo que explica el crecienteinterés en la combinación de materiales inorgánicos para la obtención de nuevoscompuestos con una mejora esta propiedad, también necesarias yfavorables para la ingeniería de tejidos11,12. El objetivo de la presente investigación fue determinar el efecto en el proceso de regeneración ósea en un modelo animal de unbiomaterial confeccionado en forma de membrana basado en Qt e HA.

Metodología

Fue realizado un estudio experimental en modelo animal usando una población de 27 ratasde la cepa Wistarde 4-5 meses de edad adulta, de 500 gr. de peso, del género masculino.

Confección de la membrana

Para la preparación de la membrana se utilizaron 5grQt certificado(Quitosan® Guinama, S.L.U) en una solución de ácido acético al 99%,dejándose en agitación constante por más de 12 horas obteniendo así un gel. El volumen total de la solución fue doblemente filtrada,para eliminar las impurezas y microorganismos que pudieran contaminar la solución. Unavez filtrado, la solución se mezcló con 0.2gr de HA nanométrica y sedispensó un volumen en placas de Petri, las cuales se llevaron a una estufa de calorseco a 40ºC.Las películas de Qt-HA fueron neutralizadas con NaOH al 0.5% hasta sudesprendimiento de la placa de Petri y posteriormente fueron lavadas abundantemente conagua destilada. La película neutralizada secolocó en un envase para darle la forma deseada y se incubó por 2 horas a 50º C para susecado. Posteriormente se recortaron y esterilizaron en una cámara de luz ultravioleta por15 minutos para luego ser selladas en empaques de fabricación propia lista para su uso.

Evaluación ultraestructural del biomaterial

Para la evaluación ultraestructuralde la membrana de Qt-HA una muestra del biomaterial fue cubierta con unacapa de oro metalizado, por aproximadamente 15 minutos, para luego ser montadas y observadas para su análisis en unmicroscopio electrónico de barrido HITACHI® modelo S-2500.

Creación del defecto óseo y colocación de la membrana

Las muestras para estudio correspondieron a ambas tibias de cada animal, a las cuales se lesrealizó un defecto óseo quirúrgico. Para la realización del defecto óseo se realizó sedación vía intraperitoneal de los animales, administrándose ketamina 75 mg/kg. de peso más xilacina 10 mg/kg. de peso y anestesia local de la zona a intervenir mediante infiltración de Lidocaína al 2% (Rapicaine ®). Para el abordaje quirúrgico, se realizó un rasurado de la piel de la zona anterior de las extremidades posteriores, asepsia de la zona con Iodopovidona (Betadine®) al 10%, abordaje con una incisión cutánea de 15 mm de extensión longitudinal al eje de cada tibia del animal. Se procedió a la separación de los planos musculares y periósticos y una vez expuestas las tibias, se procedió a realizar un defecto óseo en cada una, rectangular, de aproximadamente 5mm de largo por 1mm de ancho y 2mm de profundidad, utilizando una fresa de diamante cilíndrica estéril a baja velocidad, en posición totalmente vertical y en refrigeración constante con solución fisiológica.

Posteriormente, se colocó el biomaterial a base de Q-HA en el defecto de la tibia derecha, siendo ésta la tibia experimental, mientras que el defecto de la tibia izquierda permaneció vacío, utilizándose como tibia control. Se limpiaron y suturaron las heridas con puntos simples utilizando catgut crómico 4-0. Se administró medicación analgésica postoperatoria con Meloxicam (Mobic®) vía subcutánea y antibioticoterapia con Sulbactam sódico 0.5gr / Ampicilina sódica 1gr (Unasyn®), diluidos en 10 ml. de solución fisiológica, dosis única vía intramuscular.

Eutanasia y obtención de las muestras para estudio

Los animales fueron divididos en dos grupos organizados según el tiempo deeutanasia. Un grupo de 11 ratas se les realizó la eutanasia a los 30 díaspostquirúrgicos, para coincidir con el comienzo de la fase de mineralización delremodelado óseo, donde se observa el depósito de material osteoide13. El segundo grupo, de 16 ratas, se les realizó eutanasia a los 90 díaspostquirúrgicos, tiempo en el que se reporta la culminación de la fase de mineralización enel hueso trabecular13.

La eutanasia de los animales se realizó colocando a los mismos en una campana deEnflurano completamente sellada, con una sobreexposición de 2 a 4 minutos. Serealizó la exposición completa de las tibias del animal, mediante cortes de la piel y músculocon hoja de bisturí Nª 15 y tijeras. Se almacenaron las muestras individualmente en frascos recolectores con formol al 10%.

Evaluación imagenológica

Se realizó la evaluación imagenológica mediante la toma deradiografía con un equipo radiográfico de pared (Gnatus®), graduado en intensidad 70kVp, 7mA, con tiempo de exposición de 0.4 segundos, obteniendo así una imagenradiográfica digital, mediante un captador RVG 5100 y el software 6.10.8.7 de KodakDental.

La tibia experimental y la tibia control de un mismo animal, se colocaron sobre el captadorde imagen radiográfica. Una vez obtenida la imagen digital, se le aplicó el programadensitométrico, el cual permite recorrer la imagen con el cursor registrando una valoraciónnumérica de la densidad promedio de la zona señalada por el cursor. Se obtuvieron 2valoraciones numéricas por cada tibia, la primera correspondiente a la densidad óseanormal (DON) para lo cual se promediaron medidas tomadas en diferentes puntos, superiore inferior al defecto. La segunda medida correspondió a la densidad ósea del defecto(DOD), para lo cual se promediaron medidas en diferentes puntos dentro de los límites deldefecto óseo creado (Fig. 1). Estas medidas fueron tomadas en ambas tibias para sucomparación estadística. Los datos fueron recolectados y calculadas las medias ± desviación típica.

Procesamiento y análisis histopatológico

Todas las tibias fueron descalcificadas individualmente durante 1 semana en ácidoclorhídrico más formaldehído (Osteomoll®). Posteriormente las muestran fueron colocadasen casetes e introducidas en una máquina procesadora de tejidos (StartTissue – Tek II), enla cual se cumplieron las fases de deshidratación con alcoholes de gradación creciente, aclaramiento con xilol, inclusión en parafina líquida, cortes de 5μm con un micrótomo, montaje en láminas portaobjeto y finalmente tinción con hematoxilina y eosina.

Las láminas fueron observadas por medio de microscopio óptico para determinar lapresencia del material y la neoformación ósea, en escalas nominales y ordinales de cadavariable respectivamente.

Evaluación ultraestructural de las muestras

Cuatro tibias fueron embebidas en etanol durante una semana para eliminar los restosdel formol provenientes del almacenamiento de las mismas. Posteriormente se procesaroncomo se refirió anteriormente para el estudio ultraestructural de la membrana, obteniendo así una descripción cualitativa de las muestras.

Análisis estadístico de los datos

Las variables fueron analizadas descriptivamente mediante medias y desviación estándar y porcentajes dependiendo de la naturaleza del dato. Las variables numéricas fueroncomparadas mediante la prueba de t de student y las medias comparadas. Las variablescategóricas nominales fueron comparadas usando chi2. El nivel de confiabilidad fueestablecido 5% (α=0.05) y todo valor p‹0,05 fue considerado estadísticamentesignificativo.

Resultados

Análisis densitométrico de las tibias

En el grupo de 1 mes, las tibias controles obtuvieron un valor medio de DON de13,48±11,12. En el caso de las tibias experimentales la media fue de 12,39±7,53 (Tabla I). Aunque la media de las tibias controles es discretamente mayor, los resultados nomostraron diferencias estadísticamente significativas (p= 0,794). En el grupo de 3 meses,las tibias controles obtuvieron valores medios de densidad ósea de 11,95±4,47. En el caso de lastibias experimentales la media fue de 8,68±5,42 (Tabla II). Similar a los resultadosal mes, no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre las muestras (p=0,115).

Cambios histológicos tisulares en los defectos de las tibias

En relación a la presencia del material, el 80% de las tibias experimentales, aun mostraban la presencia histológica del biomaterial pasado 1 mes postoperatorio (Fig. 2). A los 3 meses postoperatorios, en el 86.6% de las tibias pudo observarse parte del biomaterial (Fig.2). Con respecto a la neoformación ósea al mes del postoperatorio, la misma fue mayor enel grupo de tibias experimentales, sin embargo los resultados no fueron estadísticamentesignificativos (p=0,329) (Tabla III). Sin embargo, a los 3 mesespostoperatorios, se logró observar una neoformación ósea mayor estadísticamentesignificativa en el grupo de tibias experimentales (p= 0,011) (Tabla IV).

Cambios ultraestructurales

La microfotografía al mes de la tibia control mostró una discreta reparación del defectoóseo (Fig. 3). En la tibia experimental pudo apreciarse la presencia del materialimplantado de Qt-HA y el tejido organizado a su alrededor para la neoformación ósea (Fig. 3). Asímismo pudieron detectarse las células óseas migrando hacia el material.

En lamuestra control a los 90 días, se observómenor cantidad de tejido óseo en el defecto vacío y la presente formación de fibras colágenas de formadesorganizada en el centro del defecto (Fig. 3). En la tibia experimental se observó eldefecto casi cubierto en totalidad de tejido óseo neoformado (Fig. 3).

Discusión

Diferentes biomateriales absorbibles hechos de varios tipos de polímeros, incluyendoQt, han sido desarrollados hoy en día. En el presente estudio la implantación de una membrana de Qt-HA demostró inducir efectivamente la regeneración ósea. Otros estudios han señalado lapromoción de la síntesis de colágeno y la diferenciación de células osteogénicascon eluso deQt13-15.

A pesar de todas las bondades que ofrece el Qt, carece de laspropiedades mecánicas suficientes que demanda un material de regeneración ósea enodontología. En este trabajo, esa propiedad fue reforzada, de manera efectiva, mediante la adición de HA. El refuerzo inorgánico de este tipo de compuestos, proporciona resistenciay rigidez, y mediante la incorporación de Qt, las propiedades biológicas fueronmejoradas, resultando en una matriz polimérica que funciona como relleno, con una sumade propiedades que resulta muy ventajosa8,16.

Estudios han demostrado que los biomateriales compuestos de Qt-HApueden servir como andamio tridimensional, participando en la fijación celular in vitro y lamigración ósea en los tejidos periodontales17,18. El Qt brinda la propiedad bioactiva, lacual promueve la adhesión de los componentes tipo factores de crecimiento y metaloproteinasas, por loque puede ser ampliamente utilizado en el campo de la regeneración ósea19.

Se ha estudiado el efecto del tamaño de las partículas de HA en la regeneración ósea y pareciera que el tamaño interfieren de manera inversamente proporcional con la generación de hueso 20,21. La HAnanoparticulada tiene propiedades especiales, gracias a su pequeñotamaño y a su gran área de superficie específica lo cual resulta en un aumentosignificativo en la adsorción de proteínas y la adhesión de osteoblastos en esta cerámica detamaño nanométrico22.

Shinet al.23 evaluaron el efecto de membranas de Qt a diferentes concentraciones deHA para la regeneración ósea de defectos craneales de ratas, observando que en todos losgrupos experimentales, independientemente de la concentración del material, presentabanuna mayor formación ósea local entre la segunda y octava semana de implantación. A medida que la dosis de HA aumentó, hubo mayor neoformación ósea en elperíodo de curación temprana, mientras que no hubo diferencia significativa con el pasodel tiempo. Contrario a los resultados de nuestro estudio, la primera evaluaciónpostoperatoria que se realizó a las 4 semanas, a pesar de que la neoformación ósea fuemayor en el grupo al que se le aplicó el biomaterial, no mostró diferencias estadísticamentesignificativas. Esto puede deberse a la baja concentración de HA en las membranasimplantadas, concentración que pareciera ser proporcional a la neoformaciónósea en etapas tempranas, sin embargo ésta proporción se hacer inversa a lo largo de la evolución del proceso.

En concordancia con Liljenstenet al.24 el material en las tibias se conservó hasta 3 mesesdespués de su colocación, sugiriendo una reabsorción lenta del mismo, sin embargo,en nuestro estudio, en los casos donde se observaba presencia del material, era en donde laneoformación ósea era más evidente, sugiriendo así que la lenta degradación de la membrana propició la formación de tejido óseo.

Peral et al.25 realizaron un estudio experimental sobre la regeneración ósea mandibular deratas con diferentes biomateriales, donde se realizó valoración histológica y radiológica deltejido neoformado. En correspondencia con nuestro estudio no hubo semejanza entre losresultados radiográficos y los resultados histológicos, sugiriendo que la valoraciónradiográfica por sí sola, no debe ser utilizada como único criterio para evaluar laregeneración ósea, debiendo correlacionarse con los hallazgos histológicos para asegurar laevaluación objetiva del proceso.

Conclusiones

El biomaterial desarrollado a base de Qt e HA fue de sencilla elaboración, viable,accesible económicamente, de fácil manipulación y tolerable para los animales en estudio.Su biodegradabilidad fue lenta y se demostró que interactúa positivamente con el tejidoóseo, acelerando el proceso de neoformación ósea a los 3 meses postoperatorios. El uso deQt e HA podría constituir un excelente andamios para laregeneración ósea de alta bioactividad y lenta biodegradabilidaddada su efectividad en el modelo animalestudiado.

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